【一起读文献】The EMBO Journal：TDP-43过度磷酸化在神经疾病的机制

导读：   

    TAR DNA结合蛋白(TDP-43)是肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)患者的主要聚集蛋白，也在高达50%的阿尔茨海默病患者中形成病理聚集。它是一种普遍表达的RNA结合蛋白(RBP)，在RNA加工中具有关键功能，例如调节选择性剪接和聚腺苷酸化、miRNA加工、mRNA稳定性和定位。TDP-43病理与神经退行性变密切相关，其功能丧失机制和功能获得机制都被认为会导致神经元功能障碍，最终导致神经退行性变。近期，《The EMBO Journal》期刊发表了题为“Disease-linked TDP-43 hyperphosphorylation suppresses TDP-43 condensation and aggregation”的论文，作者团队发现TDP-43的C末端过度磷酸化可能是一种保护细胞的反应，以对抗TDP-43的固化，而不是像迄今所假设的那样，是TDP-43病理的驱动因素。

   为了研究磷酸化如何影响TDP-43的相变，作者在大肠杆菌中表达并纯化了带有增溶MBP标签和His6-标签的未磷酸化的全长TDP-43。然后，作者在体外用酪蛋白激酶1增量(CK1TDP)磷酸化纯化的蛋白，这是一种先前报道在疾病相关位点磷酸化δ-43的激酶，并用磷酸化特异性抗体证实了C末端丝氨酸的磷酸化(S403/S404；S409/S410)。质谱分析检测到几个额外的丝氨酸/苏氨酸位点上的磷酸化，SDS-PAGE中的运行行为表明多个位点上的过度磷酸化(图1B)。然后，作者用TEV蛋白酶切割MBP标签，诱导未磷酸化的TDP-43与体外磷酸化的TDP-43的相分离，并使用离心法从清除的上清液中分离缩合物(C)(图1A)。裂解的TDP-43主要在凝集液中(S/[S+C]比~0.25)，而体外磷酸化的TDP-43主要在上清液中(S/[S+C]比>0.6；图1B和C)。单独加入三磷酸腺苷(ATP)或CK1δ后，tdp-43的沉降未见减少，表明这确实是由于tdp-43中添加了磷酸基团所致。

模拟疾病连锁磷酸化的C-末端拟磷取代抑制TDP-43的相分离

为了研究明确的疾病相关磷酸化位点，作者产生了含有不同数量的拟磷酸化丝氨酸到天冬氨酸(S-to-D)突变或相应的丝氨酸到丙氨酸(S-to-A)突变的仿磷蛋白作为对照。仿磷取代依赖于用带负电荷的氨基酸取代磷酸化的丝氨酸或苏氨酸，从而模仿磷酸基的负电荷。尽管他们低估了电荷变化(天冬氨酸的净电荷=−1，而不是磷酸基的−2)，并且并不总是准确地模拟磷基的化学，但磷仿生已成功地用于探索磷酸化残基的生物功能。S409/S410上的磷酸化是聚集的TDP-43在所有ALS/FTD亚型中高度特异和一致的特征，并用磷酸化位点特异性抗体在人死后组织中检测到5个磷酸化位点(S379，S403，S404，S409和S410)。因此，作者突变了这些丝氨酸，创造了“2D”和“5D”变体以及相应的“2A”和“5A”对照(图1D)。基于一项质谱研究，该研究发现ALS脊髓TDP-43的C端LCD中有12个丝氨酸发生磷酸化，作者还突变了这12个位点(S373、S375、S379、S387、S389、S393、S395、S403、S404、S407、S409和S410)，创建了“12D”或“12A”变体(图1D)。有趣的是，PLAAC网络工具允许使用隐马尔可夫模型(HMM)算法预测可能的朊蛋白子序列，预测了与野生型(Wt)和12A蛋白相比，仿磷12D变异体中C-末端区域的朊病毒样特征减少(附录图S2)。为了在实验上研究相分离，所有突变体都被表达和纯化为TDP-43-MBP-His6融合蛋白，并通过浊度、沉淀法或显微凝集试验检测TEV蛋白酶介导的MBP标签裂解引起的相分离。浊度测量显示，TDP-43Wt的相分离如预期的那样随浓度增加而增加，而2D和5D突变体的增加不那么明显，12D突变体的相分离没有随浓度增加而增加(图1E)。在相应的S-to-A对照突变(图1E)中，拟磷突变(Wt>2D>5D>12D)引起的浊度逐渐下降的程度并不相同，因此相分离的抑制不是由于这些位置上丝氨酸的损失，而是由于D取代引入的额外负电荷。在磷酸盐缓冲液而不是Hepes缓冲液中的浊度分析得出了类似的结果，沉降试验证实随着拟磷突变数量的增加，TDP-43缩合逐渐受到抑制。

磷酸化的S-to-D取代导致TDP-43缩合物变圆，而S-to-A突变导致无定形的聚集状形态

有趣的是，明亮的视野显微镜显示，TDP-43Wt形成了相对较小的无定形凝聚物，这表明了类似固体的材料特性(图1F)。相反，模仿磷酸盐的S-to-D蛋白形成的缩合物较少，但要大得多，而且更圆(图1F，量化见G-I)，这表明缩合物的行为更像液体，因此凝析油融合成更大的液滴。同样，观察到的变化与拟磷化突变的数量有关，即12D突变体的变化最明显，它形成的蛋白液滴很少，但很大，而且是完美的圆形。(请注意，这几种大型凝析油最有可能在浊度检测中逃脱检测，因为在检测过程中快速沉淀)。相比之下，S-to-A对照变体形成了许多小的、无定形的凝聚体，并且比TDP-43Wt(图1F)具有更不规则的聚集态外观。这一表型表明相应丝氨酸中的OH基团影响TDP-43的材料性质，并有助于阻止其聚集。在磷酸盐缓冲液而不是Hepes缓冲液中进行测定时也得到了类似的结果，只是12D在磷酸盐缓冲液中只形成了很少的小凝聚物，这可能是因为磷酸盐缓冲液中的离子可能会屏蔽TDP-43分子之间的某些吸引人的相互作用，从而不利于相分离。综上所述，这些结果表明模仿疾病相关的C-末端TDP-43磷酸化的仿磷取代降低了TDP-43相分离成无定形凝聚体的倾向，并表明C端磷酸化的TDP-43具有更动态的液体样行为。

C-端仿磷取代产生更多液体状、动态的TDP-43冷凝物

为了测试仿磷突变是否真的使TDP43更像液体，作者用旋转圆盘共聚焦显微镜对Alexa488标记的Wt、5D和12D凝聚体进行了实时成像。对于TDP-43Wt，在几分钟的时间过程中没有观察到融合事件。取而代之的是，细小的冷凝物彼此粘连成链状排列(图2A)。相比之下，5D凝析液偶尔会慢慢相互熔化，12D凝析液一接触就很容易熔化，并松弛成完美的圆形球体，显示出液滴性质(图2A)。为了评估TDP-43分子在冷凝物中的流动性，作者对冷凝物进行了半漂白，并分析了漂白后一半的荧光恢复(FRAP)。在TDP-43Wt冷凝物中，荧光恢复非常缓慢，表明TDP-43分子的流动性较低，而在5D和12D冷凝物中恢复更快(图2B和C)，这与仿磷TDP-43与“未经修饰”的TDP-43相比流动性增加一致。综上所述，CT端区域的仿磷S-to-D取代增强了TDP-43凝聚物的流动性，表明该区域的磷酸化可能抵消了TDP-43形成固体、不可逆聚集体的趋势。

C-末端仿磷取代降低TDP-43聚集

为了解决磷酸化是否确实抵消TDP-43聚集的问题，作者进行了根据已发表的协议修改的体外聚集分析。在本实验条件下，荧光标记的TDP-43-MBP-His6的TEV裂解产生无定形的TDP-43聚集体，可通过共聚焦显微镜观察到。与Wt或12A相比，仿磷5D或12D蛋白分别形成了更小和更少的聚集体(图2D)，这表明C-末端TDP-43磷酸化可以有效地抑制TDP-43聚集。为了对形成的聚集体进行生化表征，作者在相同的测定条件下进行了半变性洗涤剂-琼脂糖凝胶电泳(SDD-AGE)，只是在没有TEV的情况下，因为在这些条件下可以看到MBP标记的TDP-43聚集体比TDP-43慢，并且可以看到抵抗0.5%SDS的明显的寡聚/聚合物种(附录图S3)。与TDP-43Wt和5D相比，12D显示出减少和延迟的齐聚和高分子量物种的形成(图2E，图2F所示的等量蛋白质输入)。相反，12A以更高的速度形成了抗SDS的低聚物/高分子量物种，再加上作者对TDP-43凝聚物的显微图像(图1F)，这表明C-末端丙氨酸取代使TDP43更容易聚集。综上所述，在体外，模拟ALS患者磷酸化模式的C末端仿磷取代减少了耐SDS的高分子量低聚物和TDP-43聚集体的形成。

为了在分子水平上了解C端TDP-43磷酸化对相分离的影响，作者对无序且具有和不具有仿磷酰基取代的TDP-43 LCD进行了粗粒度和原子级的MD模拟。在粗粒度模拟中，作者可以获取相关的长时间和大长度尺度来表征相行为，而在原子模拟中，作者可以高分辨率和高精度地解决凝析油之间的相互作用。作者发现，仿磷取代局部减少了蛋白质-蛋白质的相互作用，增加了蛋白质-溶剂的相互作用(图3)。在粗粒度模拟中，TDP-43Wt和12D相的LCD自发分离形成凝聚物(如图3A的Wt所示)。然而，在相分离的缩合物中，磷酸化残基不太容易与蛋白质相互作用，并且比相应的丝氨酸残基更容易溶剂化(图3B)。12D LCDs中的天冬氨酸侧链与精氨酸发生部分补偿性相互作用，表明带电侧链的引入既引起凝析油的稳定作用，又引起凝析油的不稳定作用。重要的是，作者的模拟与之前的研究一致，这些研究强调了芳香族粘贴-粘贴相互作用在驱动类朊病毒结构域和TDP-43 LCD相分离方面的重要性。为了进一步表征TDP-43 LCDs的相互作用，作者对与分层链生长组装的致密蛋白质凝聚物(图3C)进行了原子MD模拟，以增强聚合自由度的采样。在显式溶剂和对分子相互作用的高精度原子描述的微秒动力学中，作者再次发现Wt蛋白质中的丝氨酸残基比与溶剂相互作用更容易与其他蛋白质残基相互作用(图3D)。相比之下，磷酸化天冬氨酸侧链与相对更多的水分子结合，并显示出蛋白质-蛋白质相互作用总体减少的趋势(图3D和E)。增强的侧链溶剂化在12个仿磷取代位点上是一致的。原子模拟与有利于溶剂化状态的电荷增加相一致，从而削弱了TDP-43凝聚态。

磷酸化突变和磷酸化对TDP-43 LCD 相分离现象的影响

为了表征磷酸化突变和磷酸化之间可能的差异，作者采用了高效的疏水性标尺(HPS)粗粒度模型。HPS隐含溶剂模型使作者能够量化TDP-43 LCD变体的相行为差异。与全长TDP-43(图1)上的实验一致，12D LCD相分离，但与Wt相比，更多的蛋白质留在稀相(图3F-H)。事实上，从密度分布计算转移ΔGTRANS的过剩自由能，报告了将一条链从饱和密度下的稀溶液移动到凝析油的稠相是多么有利，结果表明12D LCDs在凝析油中不太容易相互作用。根据显式溶剂的粗粒度模拟，模拟磷酰基取代导致的C-末端区域局部接触的丧失只被新的蛋白质-蛋白质与精氨酸的相互作用部分补偿。正如作者的实验所预期的那样，12A取代稳定了TDP-43 LCD凝聚体，稀相中几乎没有蛋白质残留(图3F)。磷酸化以剂量依赖的方式调节LCD凝聚体的稳定性。加入五个磷基(5PS)可以得到密度稍低的LCD冷凝物，但总体来说，过剩的转移自由能与Wt相当。相反，在作者的模拟中，完全磷酸化所有12个位点(12pS)溶解了LCD凝聚体，在密度分布中没有明显的峰(图3F)。总体而言，用HPS模型模拟形成凝聚体的饱和密度排序为12A≫Wt~5PS>12D≫12pS。因此，计算预测：(i)磷酸化确实可以溶解缩合物，(ii)由于磷酸丝氨酸的负电荷比天冬氨酸大，因此磷酸化可能比磷酸化取代有更强的作用。

接下来，作者转向细胞实验，研究CTr-TDP-43磷酸化如何影响TDP-43在细胞中的行为和功能。由于TDP-43在疾病状态下被发现过度磷酸化，这种PTM可能对蛋白质产生有害的影响，并导致TDP-43的错误定位和/或功能障碍，从而导致神经退行性变。为了解决这种可能性，作者在HeLa细胞中瞬时表达了不同的myc标记的TDP-43突变体(Wt，12D，12A)，并分析了它们的细胞内定位、核输入和RNA处理功能。所有三个TDP-43变异体都显示出主要的核稳态定位。作者还通过活细胞成像在荷尔蒙诱导的报告分析中比较了它们的核输入率。在这个实验中，一个含有核定位信号(NLS)的目的蛋白被融合到一个串联的EGFP和糖皮质激素受体(GCR)的两个激素结合域上，后者将报告蛋白保留在细胞质中。在加入类固醇激素(地塞米松)后，报告蛋白通过目标蛋白中的NLS从细胞质中释放并输入到细胞核中。作者检查了含有不同TDP-43变体(Wt、12D、12A)的报告，发现它们的输入率是无法区分的(图4A和B)。为了评估过度磷酸化的TDP-43是否在RNA加工中显示出功能障碍，作者首先评估了它在HeLa细胞中瞬时过表达时自动调节自身水平的能力。然而，内源性TDP-43被所有三个myc-TDP-43变异体下调的程度相同(图4C)，表明过度磷酸化的TDP-43通常可以与自己的30UTR结合并自动调节自己的水平。与这些发现一致，重组TDP-43Wt，12D和12A在电泳迁移率改变分析(EMSA)中显示与体外转录的RNA结合，该RNA由自动调节的TDP-43结合位点(图4D)或合成(UG)12RNA组成。其次，作者研究了两个已知的TDP-43剪接靶的剪接，这两个靶在丢失TDP-43后被错误剪接。在siRNA介导的内源性TDP-43表达沉默和抗siRNA的myc-TDP-43Wt、12D或12A重新表达后，所有三个TDP-43变异体都完全恢复了Skar和Bim外显子3的剪接(图4E)，表明拟磷酸化TDP-43在剪接调控中的正常功能。TDP-43的正常核定位和自我调节也在一个避免高表达和具有同质表达水平的细胞系统中复制，即在过夜加入多西环素后表达不同myc-TDP-43变体(wt，12d和12a)的U2OS细胞系中稳定可诱导的FLP-1。综上所述，尽管不能排除对其他RNA靶标/RNA加工事件或其他细胞类型的细胞内转运的影响，作者的数据表明C端TDP-43过度磷酸化并不是疾病中TDP-43胞浆错误定位或RNA调节功能受损的主要原因。

图4.磷酸化取代不会改变TDP-43核输入的速率，也不会损害TDP-43的自动调节、RNA结合或选择性剪接功能

最后作者研究了C端TDP-43磷酸化对细胞MLO中TDP-43缩合的影响。首先，作者使用定量分析方法在受控条件下测量了半通透性HeLa细胞中重组蛋白的SG结合(图5A)。与作者的体外缩合实验一致，增加仿磷S-to-D取代的数量导致TDP-43的SG结合逐渐减少。在体外，磷酸化的TDP-43显示出与12D蛋白相似甚至更强的SG结合减少(图5B和C)，表明激酶引入的仿磷取代基和磷酸基对TDP-43的SG结合有相似的影响。其次，作者在完整的HeLa细胞中表达了不同的TDP-43变异体，以分析它们在应激诱导的MLO中的募集。为此，作者使用siRNA抑制了内源性TDP-43的表达，然后重新引入了抗siRNA的myc标记的TDP-43Wt、12D或12A，从而避免了通过N-末端结构域与内源性TDP-43的齐聚。用H2O2短期氧化应激处理可引起TDP-43的部分胞浆重新定位，并导致TDP-43Wt和12A的招募，但显著减少12D突变体到TIA-1阳性SGS的招募(图5D和E，关于未转染细胞的对照染色)。由于核定位信号的点突变，核输入缺陷的TDP-43(图5F和G)被强烈错定位到细胞质中，也得到了类似的结果。最后作者研究了TDP-43在亚砷酸盐诱导的核体(NBS)中的招募，发现TDP-43Wt和12A很容易被招募到应激诱导的NBS中，而仿磷12D蛋白仍然分散在核质中(图5H-J，对未转染细胞的对照染色)。TDP-4312D在亚砷酸盐处理的稳定诱导U2OS细胞系中也完全分散，而TDP-43WT和12A在亚砷酸盐处理后定位于NBS。综上所述，模仿疾病相关的TDP-43磷酸化的仿磷取代抑制了TDP-43在相分离的MLO中的定位，这些MLO可能是病理性TDP-43聚集的缩合位点。

图5.磷酸化和拟磷取代减少TDP-43在应激诱导的无膜细胞器中的募集

拟磷酸化取代后增强了TDP-43在原代神经元中的溶解性并抑制SG募集

为了进一步支持磷酸化增强TDP-43的溶解性和抵消其在细胞中的聚集倾向的观点，作者在HeLa细胞中表达了不同的myc标记的TDP-43变异体，并进行了生化分级，得到了RIPA可溶(S)和RIPA不溶(I)的组分。事实上，与Wt和12A蛋白相比，12D蛋白具有明显更高的S/(S+I)比率(图6A和B)。作者还在原代大鼠神经元中表达了EGFP标记的TDP-43Wt、12D、12A或相应的NLS突变胞浆版本。然后，作者在过滤捕集试验中探索了RIPA不溶性高分子量物质。在转导的神经元中，细胞核和胞浆12D蛋白都显示RIPA不溶性TDP-43的数量明显减少(图6C)。转导神经元的共聚焦显微镜显示，NLS突变的12D蛋白完全分散定位，而TDP-43Wt和12A在神经元细胞质中显示出更颗粒状、浓缩的模式(图6D)。此外，NLS突变体TDP-43Wt和12A很容易招募到热休克诱导的G3BP1阳性的SGS中，而TDP-4312D则不能(图6E)。因此，作者得出结论，模仿疾病相关的CTerinal过度磷酸化的仿磷取代降低了TDP-43凝聚成MLO并在神经元中变得不可溶的趋势。基于这些发现，作者推测TDP-43磷酸化可能是一种细胞反应，以对抗病理性TDP-43聚集。

图6.模拟磷酸化取代增强TDP-43在HeLa细胞和原代神经元中的溶解度

小结

   作者团队相关实验数据表明激酶抑制剂的有益效果可能不是TDP-43磷酸化减少的直接结果，而是由其他机制介导的。同时TDP-43至少在HeLa和U2OS细胞中的一些必要的RNA处理功能(自动调节和某些剪接事件的调节)、RNA结合和核定位、核输入不受C-末端过度磷酸化的影响，因此可以说明其不依赖于TDP-43的相分离和固化能力。并且在ALS/FTD包涵体上检测到的C-末端TDP-43磷酸化对TDP-43聚集有类似的抑制作用，强调了在病理性包涵体上检测到的异常PTM可能不一定都是蛋白质聚集的驱动因素，但也可能具有保护性的、抗聚集的作用，然而这些作用后来被其他致病机制推翻。

END

精读论文请下载原文：

Gruijs da Silva LA, Simonetti F, Hutten S, Riemenschneider H, Sternburg EL, Pietrek LM, Gebel J, Dötsch V, Edbauer D, Hummer G, Stelzl LS, Dormann D. Disease-linked TDP-43 hyperphosphorylation suppresses TDP-43 condensation and aggregation. EMBO J. 2022 Feb 3:e108443.

 编译   李昀峰